ATP含量試劑盒(酶法),微板法

ATP含量試劑盒(酶法),微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 ATP 含量測定試劑盒說明書 （貨號：WS7580W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 三磷酸腺苷（ATP）是生物體內能量轉換最基本的載體,是生物體內最直接的能量來源， 測定 ATP 含量并且計算能荷，能夠反映能量代謝狀態。 三磷酸腺苷（ATP）在己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶混合酶的作用下，使 ATP 水解 并伴隨著 NADPH 的生成，通過檢測 340nm 下 NADPH 的增加量，進而計算得到 ATP 的 含量。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下或離心，使粉劑落 入底部，再加 1.1mL 蒸餾水備用。 試劑二 粉劑×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下或離心，使粉劑落 入底部，再加 1.1mL 蒸餾水備用。 試劑三 16mL 液體×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下或離心，使粉劑落 入底部，再加 1.1mL 蒸餾水備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、恒溫培養箱、可調式移液槍、研缽和蒸餾水。 四、ATP 含量檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織加入研缽中，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清液，置冰上待測。 【注】：也可以按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例提取。 ② 細菌/真菌樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內，離心棄上清；取 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清液，置冰上待測。 【注】：也可按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：澄清的液體直接檢測；若渾濁則離心后取上清檢測。 ④ 高蛋白含量樣本： ④-1：稱取約 0.1g 組織加入研缽中，加入 1mL 蒸餾水，進行勻漿，轉至 EP 管中，于 95℃水浴中煮 5min，取出冷卻至室溫后于 12000rpm，室溫離心 10min，上清液待測。 ④-2：或稱取約 0.1g 組織加入研缽中，加入 0.5mL 高氯酸（0.5M），進行冰浴勻漿， 8000rpm，4℃離心 10min，取全部上清至另一 EP 管中，再加入與上步所取上清液等體 積的 KOH 或 NaOH（0.5M）混勻，使整個液體 PH 近中性，若澄清直接檢測，若渾濁 則 8000rpm，4℃離心 5min 后取上清液測定，此時整個上清液體積記為 V3。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30 min 以上，調節波長到 340nm。本試劑盒僅供科研使用 2 ② 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 10 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 160 混勻，室溫（25℃）下，5min后于340nm 處讀取A1值。 試劑四 10 混勻，室溫（25℃）下，反應15min 于340nm處讀取A2值，ΔA=A2-A1。 【注】若ΔA 差值在零附近，可增加樣本量 V1（如 40μL，則試劑三相應減少）。 則改變后的 V1 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本鮮重計算： ATP 含量(μmol/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V)=6.35×ΔA÷W 2、按細菌/細胞密度計算： ATP 含量(μmol/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(500×V1÷V)=0.013×ΔA 3、液體中 ATP 含量計算： ATP 含量(μmol/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷V1=6.35×ΔA 4、高蛋白樣本中 ATP 含量計算： ATP 含量(μmol/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V)=6.35×ΔA÷W ATP 含量(μmol/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V3)=6.35×ΔA÷V3÷W ε---NADPH的摩爾吸光系數為6.3×103L/mol/cm； d---光徑距離，0.5cm； V---提取液體積，1mL； V1---樣本體積，10μL=0.01mL； V2---反應總體積，200μL=2×10-4L； ATP分子量---551.14； V3---高蛋白組織樣本最終上清液總體積，mL； W---樣本質量，g; 檢測線范圍---0.06μmol/mL-4μmol/mL。