Ca2+—ATP酶試劑盒,微板法

Ca2+—ATP酶試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 Ca2+ - ATP 酶活性測定說明書 （貨號：WS0680W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： Ca2+是細胞內重要的信號分子，細胞質基質始終維持在一個較低水平的 Ca2+濃度，Ca2+ 濃度的維持主要由 Ca2+-ATP 酶來維持，該酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和無機磷。通過 測定無機磷的量來確定該酶活性高低。 二、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 三、試劑盒的組成和配制： 【注】：全程操作需無磷環境；試劑配置用新的槍頭和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避 免磷污染。 四、Ca2+-ATP 酶活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min，取 上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量(g)：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 ② 細菌/細胞樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量(104)：提取液(mL)為 500~1000：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測；若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 700nm，所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 試劑一 100 提取液 100 樣本 100 試劑二 100 100 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 提取液 80mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 8mL 提取液，混勻溶解備用。 試劑二 粉體×1 瓶 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 15mL 提取液，混勻溶解備用。 試劑三 液體 4mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 A:粉體 mg×1 瓶 B:液體 2mL×1 瓶 4℃保存 臨用前在試劑 A 中加 1.8mL 的 B 液， 再加23.2mL的蒸餾水，混勻溶解備用。 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑本試劑盒僅供科研使用 2 37℃ 孵育 20min 試劑三 40 40 樣本 100 混勻，12000rpm，4℃離心 5min，上清液待測 ③ 顯色反應： 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.6402x - 0.0034，x 是標準品摩爾質量（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白濃度計算： 定義：每小時每毫克組織蛋白分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(V1×Cpr)÷T =15.93×(△A+0.0034)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 定義：每小時每克組織分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(W×V1÷V)÷T =15.93×(△A+0.0034)÷W 4、按細菌或細胞密度計算： 定義：每小時每 1 萬個細菌或細胞分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h /104 cell)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.032×(△A+0.0034) 5、液體中 Ca2+-ATPase 活力計算: 定義：每小時每毫升液體分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷V1÷T=15.93×(△A+0.0034) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.1mL ； V2---酶促反應總體積，0.34mL； T---反應時間，1/3 小時； W---樣本鮮重，g； 500---細菌或細胞總數，萬； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（5μmol/mL）：標準品用 10mL 試劑一溶解。（母液需在兩天內用）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根據實際樣本來調整 標準品濃度。 3 依據顯色反應階段測定管的加樣體系操作，根據結果即可制作標準曲線。 上清液 50 50 試劑四 200 200 混勻，室溫靜置 3min，700nm 下讀取各管吸光值， △A=A 測定-A 對照（每個樣本做一個自身對照）。