NADH氧化酶(NOX)試劑盒,微板法

NADH氧化酶(NOX)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 NADH 氧化酶（NADH oxidase，NOX）試劑盒說明書 （貨號：WS3080W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： NADH 氧化酶（NOX，EC 1.6.99.3）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中， 可在氧氣存在下，直接將 NADH 氧化為 NAD。該酶不僅參與 NAD 的再生，而且與免疫 反應(yīng)密切相關(guān)。 NOX 能夠?qū)?NADH 氧化為 NAD，通過檢測 NADH 于 340nm 處的下降速率，即可得 出 NADH 氧化酶活性的大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 試劑一 液體 100mL×1 瓶 -20℃保存 試劑二 液體 20mL×1 瓶 -20℃保存 試劑三 液體 16mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，再加 1.5mL 蒸餾水溶解備用。 試劑五 粉劑×3 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，每支再加 0.5mL 蒸餾水溶解 ，用不完的試劑分裝后-20℃保存， 禁止反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰、蒸餾水。 四、NADH 氧化酶（NOX）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、線粒體制備（提示：整個(gè)線粒體的提取過程須保持 4℃低溫環(huán)境）： ① 稱取約 0.2g 組織或收集 1000 萬細(xì)菌/細(xì)胞，加入 1mL 試劑一，用冰浴勻漿器或研缽冰 浴勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管后于 4℃×3000g 離心 20min。 ② 小心吸取上清液（棄沉淀）移至另一離心管中，4℃×16000g 離心 20min。用移液器移 除上清液（上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的 NOX（此 步可選做））。留下沉淀（沉淀即為線粒體）。 ③ 在沉淀（線粒體）中加入 200μL 試劑二，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超 聲 5s，間隔 3s，重復(fù) 30 次），液體置于冰上用于線粒體 NOX 酶活性測定。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取，或按照細(xì) 菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測： 1 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，設(shè)定溫度 25℃，調(diào)節(jié)波長至 340nm。 2 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 試劑三 160 試劑四 10 試劑五 10本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，室溫（25℃）靜置 3min 樣本 20 混勻，室溫（25℃）立即于 340nm 處讀 取 A1，5min 后讀取 A2，△A=A1-A2 【注】若△A 的值在零附近，可以延長反應(yīng)時(shí)間 T（如至 10min 或更長），則改變后的 反應(yīng)時(shí)間 T 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活單位。 NOX（nmol/min /mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=643.1×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活單位。 NOX（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W× V1÷V)÷T=128.6×ΔA÷W 3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 酶活定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NOX（nmol/min /104 cell）=[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.26×ΔA ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm； d---96 孔板光徑，0.5cm； V--- 加 入 提 取 液 體 積 ， 0.2mL ； V1--- 加 入 樣 本 體 積 ， 0.02mL ； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； T---反應(yīng)時(shí)間，5min； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。