輔酶Ⅱ  NADP+/NADPH含量試劑盒,微板法

輔酶Ⅱ  NADP+/NADPH含量試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 輔酶ⅡNADP+/NADPH 含量試劑盒說明書 【貨號：WS2080W 微板法 48 樣(可測 48 個 NADP+，48 個 NADPH）】 一、產品簡介： 煙*胺核苷酸的測定一直是細胞或組織在能量轉化和氧化還原狀態方面的研究熱點。 NADP+ /NADPH比值不僅是細胞氧化還原態的主要標志之一，而且在生物物質合成和抗 氧化代謝中具有重要調控作用。 本試劑盒提供一種方便，快速的檢測方法，提供特異性提取液分別提取樣品中的 NADP+ 和 NADPH，NADPH 在遞氫體作用下與一種高靈敏度的顯色劑反應生成黃色水溶性甲瓚， 在 450nm 下檢測，得到 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶特異性還原 NADP+為 NADPH，從而檢測 NADP+含量。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液A 液體120mL×1瓶 4℃保存 提取液B 液體120mL×1瓶 4℃保存 試劑一 液體μL×1支 -20℃保存 用前用1.1mL蒸餾水溶解 試劑二 粉劑mg×1支 -20℃保存 用前用1.1mL蒸餾水溶解 試劑三 液體20mL×1瓶 4℃保存 試劑四 EP管1mL×1支 4℃保存 標準品 EP管μg×1支 -20℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、輔酶ⅡNADP+/NADPH 含量測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 由于 NADP+ 和 NADPH 很不穩定，較易降解，盡量使用新鮮樣品進行檢測。 1、樣本制備（制備完成的 NAD+ / NADH 待測上清液需盡快檢測，以免降解）： ① 組織中 NADP+和 NADPH 的提取： NADP +的提取：取約 0.1g 組織（水分充足樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液 A，冰浴研 磨，全部轉移到 EP 管中（用提取液 A 補齊到 1mL），植物樣本于 95℃孵育 5min 或動物 樣本于 60℃孵育 30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心 10min； 取 500μL 上清液至新 EP 管中，再加 V1 體積的提取液中和（可分次添加提取液 B，調至 PH 約中性，并記錄 V1）；12000rpm，4℃離心 5min，取上清液置于冰上待測。 NADPH的提取：取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液B，冰浴研磨， 全部轉移到EP管中（用提取液B補齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動物樣本于60℃ 孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清 液至新EP管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提取液A，調至PH約中性，并記 錄V2）；12000rpm，4 ℃離心5min，取上清液置于冰上待測。 【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增加到 0.2g 等，可做幾個梯度選擇適合本次實驗的樣本量。 ② 細胞或細菌中 NADP+和 NADPH 的提取： NADP +的提取：先收集細胞或細菌到離心管內：取約 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液 A，冰浴研磨，全部轉移到 EP 管中（用提取液 A 補齊到 1mL），于 60℃孵育 30min，取 出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管本試劑盒僅供科研使用 2 中，再加 V1 體積的提取液中和（可分次添加提取液 B，調至 PH 約中性，并記錄 V1）； 12000rpm，4℃離心 5min，取上清液置于冰上待測。 NADPH 的提取：先收集細胞或細菌到離心管內：取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取 液 B，冰浴研磨，全部轉移到 EP 管中（用提取液 B 補齊 1mL），于 60℃孵育 30min，取 出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管 中，再加 V2 體積的提取液中和（可分次添加提取液 A，調至 PH 約中性，并記錄 V2）； 12000rpm 4 ℃離心 5min，取上清置于冰上待測。 【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增至 1000 萬等，可做幾個梯度選適合本次實驗的樣本量。 ③ 液體中NADP+和NADPH的提取： NADP +的提取：取約 0.1mL 液體，加入 1mL 提取液 A，冰浴研磨，全部轉移到 EP 管中 （用提取液 A 補齊到 1.1mL），于 95℃孵育 5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min； 12000rpm 4℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管中，再加 V1 體積的提取液中和（可 分次添加提取液 B，調至 PH 約中性，并記錄 V1）；12000rpm4℃離心 5min，取上清置冰 上待測。 NADPH的提取：取約0.1mL液體，加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部轉移到EP管中（用 提取液B補齊到1.1mL），于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清液至新EP管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提 取液A，調至PH約中性，并記錄V2）；12000rpm 4 ℃離心5min，取上清液置于冰上待測。 【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增至 0.5mL 等，可做幾個梯度選擇適合本次實驗的樣本量。 2、 上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，溫度設定 37℃，調節波長至 450nm。 ② 在 96 孔板中按下表依次加入試劑： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 150 37℃避光孵育 10min 試劑四 10 混勻， 37℃條件下，立即在 450nm 處測定吸光值 A1， 30min 后再測定 A2，ΔA=A2-A1。 【注】：若ΔA 過小，可加大樣本取樣質量 W；或增加樣本量 V1（由 20 增至 40μL，則試劑三相應減少）， 或延長反應時間（如：60min 或更長）；則改變后的相應變量需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線的公式：y =8.6631x - 0.0013：x 是 NADPH 摩爾質量（nmol），y 是ΔA。本試劑盒僅供科研使用 3 2、NADP+含量的計算： (1)按樣本鮮重計算： NADP+ (nmol/g 鮮重)=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(W÷2×V 樣÷V3) =11.54×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V1)÷W (2)按細菌或細胞密度計算： NADP+ (nmol/104 cell)=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(500÷2×V 樣÷V3) =0.023×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V1) (3)液體中 NADP+含量計算： NADP+含量(nmol/mL)=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(V 液÷2×V 樣÷V3) =115.43×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V1) 3、NADPH 含量的計算： (1)按樣本鮮重計算： NADPH (nmol/g 鮮重)=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(W÷2×V 樣÷V4) =11.54×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V2)÷W (2)按細菌或細胞密度計算： NADPH (nmol/104 cell)=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(500÷2×V 樣÷V4) =0.023×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V2) (3)液體中 NADPH 含量計算： NADPH 含量(nmol/mL)=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(V 液÷2×V 樣÷V4) =115.43×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V2) V 樣---加入反應體系中樣本體積，0.02mL； V 液---所取液體樣本體積：0.1mL； V3---NADP+提取液體積：0.5mL 提取液 A+ V1mL 提取液 B=（0.5+V1）mL； V4---NADPH 提取液體積：0.5mL 提取液 B+ V2mL 提取液 A=（0.5+V2）mL； W---樣本質量，g； 500---細胞或細菌總數，500 萬； NADPH 分子量---745.4； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1μmol/mL）：向標準品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸餾水（NADPH 不 太穩定，取出 NADPH 后請盡快使用。如果發現標準曲線不理想，很有可能是標準 品發生了降解）。 2 把母液稀釋成五個濃度梯度的標準品：0, 1, 2, 3, 4, 5 nmol/mL。也可根據實際樣本來 調整標準品濃度。 3 依據測定管加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。