輔酶Ⅰ  NAD+/NADH含量試劑盒,微板法

輔酶Ⅰ  NAD+/NADH含量試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 輔酶ⅠNAD+ / NADH 含量試劑盒說(shuō)明書(shū) 【貨號(hào)：WS1080W 微板法 48 樣(可測(cè) 48 個(gè) NAD+,48 個(gè) NADH）】 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介 煙*胺核苷酸的測(cè)定一直是細(xì)胞或組織在能量轉(zhuǎn)化和氧化還原狀態(tài)方面的研究熱點(diǎn)。 NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要?dú)涫荏w，其 NAD+/NADH 比值的 高低不僅可用于評(píng)價(jià)糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱，而且在生物物質(zhì)合成和抗氧化代謝中具 有重要調(diào)控作用。 本試劑盒提供一種方便，快速的檢測(cè)方法，提供特異性提取液分別提取樣品中的 NAD+ 和 NADH，NADH 在遞氫體作用下與一種高靈敏度的顯色劑反應(yīng)生成黃色水溶性甲瓚， 在 450nm 下檢測(cè)，得到 NADH 含量。利用乙醇脫氫酶特異性還原 NAD+為 NADH，從而 檢測(cè) NAD+含量。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液A 液體120mL×1瓶 4℃保存 提取液B 液體120mL×1瓶 4℃保存 試劑一 液體μL×1支 -20℃保存 用前用1.1mL蒸餾水溶解備用 試劑二 液體μL×1支 -20℃保存 用前用1.1mL蒸餾水溶解備用 試劑三 液體20mL×1瓶 4℃保存 試劑四 液體1.1mL×1支 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 EP管×1支 -20℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、輔酶ⅠNAD+ / NADH 含量測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 由于 NAD+ 和 NADH 很不穩(wěn)定，較易降解，盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測(cè)。 1、樣本制備（制備完成的 NAD+ / NADH 待測(cè)上清液需盡快檢測(cè)，以免降解）： ① 組織中 NAD+和 NADH 的提取： NAD+的提取：取約 0.1g 組織（水分充足樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液 A，冰浴研磨， 全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中（用提取液 A 補(bǔ)齊到 1mL），植物樣本于 95℃孵育 5min 或動(dòng)物樣本 于 60℃孵育 30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管中，再加 V1 體積的提取液中和（可分次添加提取液 B，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V1）；12000rpm，4℃離心 5min，取上清液置于冰上待測(cè)。 NADH的提取：取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液B，冰浴研磨， 全部轉(zhuǎn)移到EP管中（用提取液B補(bǔ)齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動(dòng)物樣本于60℃ 孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清 液至新EP管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提取液A，調(diào)至PH約中性，并記 錄V2）；12000rpm，4 ℃離心5min，取上清液置于冰上待測(cè)。 【注】：若測(cè)出值較低，可加大樣本取樣量，如增加到 0.2g 等，可做幾個(gè)梯度選擇適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。 ② 細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+和 NADH 的提取： NAD+的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)：取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液 A， 冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中（用提取液 A 補(bǔ)齊到 1mL），于 60℃孵育 30min，取出后 立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管中，本試劑盒僅供科研使用 2 再加 V1 體積的提取液中和（可分次添加提取液 B，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V1）；12000rpm， 4℃離心 5min，取上清液置于冰上待測(cè)。 NADH 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)：取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液 B，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中（用提取液 B 補(bǔ)齊 1mL），于 60℃孵育 30min，取出 后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管中， 再加 V2 體積的提取液中和（可分次添加提取液 A，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V2）；12000rpm 4 ℃離心 5min，取上清置于冰上待測(cè)。 【注】：若測(cè)出值較低，可加大樣本取樣量，如增至 1000 萬(wàn)等，可做幾個(gè)梯度選適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。 ③ 液體中NAD+和NADH的提取： NAD+的提取：取約 0.1mL 液體，加入 1mL 提取液 A，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中（用 提取液 A 補(bǔ)齊到 1.1mL），于 95℃孵育 5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管中，再加 V1 體積的提取液中和（可分次添 加提取液 B，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V1）；12000rpm，4℃離心 5min，取上清液置于冰 上待測(cè)。 NADH的提取：取約0.1mL液體，加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到EP管中（用 提取液B補(bǔ)齊到1.1mL），于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清液至新EP管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提 取液A，調(diào)至PH約中性，并記錄V2）；12000rpm 4 ℃離心5min，取上清液置于冰上待測(cè)。 【注】：若測(cè)出值較低，可加大樣本取樣量，如增至 0.5mL 等，可做幾個(gè)梯度選擇適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。 2、 上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，溫度設(shè)定 37℃，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm。 ② 在 96 孔板中按下表依次加入試劑： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 150 37℃避光孵育 10min 試劑四 10 混勻， 37℃條件下，立即在 450nm 處測(cè)定吸光值 A1， 30min 后再測(cè)定 A2，ΔA=A2-A1。 【注】：若ΔA 過(guò)小，可加大樣本取樣質(zhì)量 W；或增加樣本量 V1（由 20 增至 40μL，則試劑三相應(yīng)減少）， 或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（如：60min 或更長(zhǎng)）；則改變后的相應(yīng)變量需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 4.2609x - 0.0071：x 是 NADH 摩爾質(zhì)量（nmol），y 是ΔA。本試劑盒僅供科研使用 3 2、NAD+含量的計(jì)算 (1))按樣本鮮重計(jì)算： NAD+ (nmol/g 鮮重)=[(ΔA+0.0071)÷4.2609]÷(W÷2×V 樣÷V3) =23.47×(ΔA+0.0071)× (0.5+V1)÷W (2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： NAD+ (nmol/104 cell)=[(ΔA+0.0071)÷4.2609]÷(500÷2×V 樣÷V3) =0.047×(ΔA+0.0071)× (0.5+V1) (3)液體中 NAD+含量計(jì)算： NAD+含量(nmol/mL)=[(ΔA+0.0071)÷4.2609]÷(V 液÷2×V 樣÷V3) =234.7×(ΔA+0.0071)× (0.5+V1) 3、NADH 含量的計(jì)算： (1)按樣本鮮重計(jì)算： NADH (nmol/g 鮮重)=[(ΔA+0.0071)÷4.2609]÷(W÷2×V 樣÷V4) =23.47×(ΔA+0.0071)×(0.5+V2)÷W (2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： NADH (nmol/104 cell)=[(ΔA+0.0071)÷4.2609]÷(500÷2×V 樣÷V4) =0.047×(ΔA+0.0071)×(0.5+V2) (3)液體中 NADH 含量計(jì)算： NADH 含量(nmol/mL)=[(ΔA+0.0071)÷4.2609]÷(V 液÷2×V 樣÷V4) =234.7×(ΔA+0.0071) ×(0.5+V2) V 樣---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL； V 液---所取液體樣本體積：0.1mL； V3---NAD+提取液體積：0.5mL 提取液 A+ V1mL 提取液 B=(0.5+V1) mL； V4---NADH 提取液體積：0.5mL 提取液 B+ V2mL 提取液 A=(0.5+V2) mL； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)； NADH 分子量---663.4； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1μmol/mL 的 NADH）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1.41ml 蒸餾水（ NADH 不太穩(wěn)定，取出 NADH 后請(qǐng)盡快使用。如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不理想，很有可能 是標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生了降解）。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 1, 2, 3, 4, 5 nmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái) 調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。