糖原磷酸化酶b(GPb)試劑盒,微板法

糖原磷酸化酶b(GPb)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 

糖原磷酸化酶 b（GPb）試劑盒說明書 

（貨號：WS5650W 微板法 48 樣）

一、產(chǎn)品簡介： 糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代謝的關(guān)鍵酶， 使糖原分子從非還原端逐個(gè)斷開α-1，4-糖苷鍵移去葡萄糖基，釋放 1-磷酸葡萄糖，直至臨 近糖原分子α-1，6-糖苷鍵分支點(diǎn)前 4 個(gè)葡萄糖基處。GP 分為有活性的糖原磷酸化酶 a（GPa） 和無活性的糖原磷酸化酶 b（GPb）兩種形式。GPb 在一定濃度的腺苷酸（5， -AMP）存在 下可被激活。 本試劑盒提供一種快速，靈敏和簡便的檢測方法，GP 催化糖原和無機(jī)磷產(chǎn)生葡萄糖殘基 生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化 NADP+還原 成 NADPH，接著與特異顯色劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)，通過檢測該有色物在 450nm 的增加速率， 進(jìn)而計(jì)算出 GP 酶活性大小。添加一定濃度的腺苷酸（5， -AMP）時(shí)測定 GP（GPa 和 GPb） 活性，未添加腺苷酸（5， -AMP）時(shí)測定 GPa 活性，GP 活性減去 GPa 活性得到 GPb 活性。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑三 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑四 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑五 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰。 四、糖原磷酸化酶 b（GPb）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上 清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液；超聲波破 碎細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；4oC 約 12,000rpm 離心 10min，取上清作為待測樣品。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，設(shè)置溫度 30℃,調(diào)節(jié)波長至 450nm。本試劑盒僅供科研使用 2 ② 試劑放在 30℃水浴 5min； ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 10 10 試劑一 10 試劑二 10 10 試劑三 10 10 試劑四 10 10 試劑五 140 150 混勻，30℃條件下孵育 10min 試劑六 10 10 混勻，30℃條件下，2min 時(shí)立即于 450nm 處讀取吸光值 A，△A=A 測定-A 對照（每個(gè)樣本需做一個(gè)樣本自身對照）。 【注】：1. 若ΔA 過小，可以延長反應(yīng)時(shí)間 T（如：10min 或更長）再讀取 A2，或增加樣本量 V1（如增 至 20μL，則試劑五相應(yīng)減小），重新調(diào)整的反應(yīng)時(shí)間 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2. 若 A 測定值大于 1.5，可縮減反應(yīng)時(shí)間 T（如：1min 或更短）再讀取 A2，或減少樣本量 V1（如 減至 5μL，則試劑五相應(yīng)增加），重新調(diào)整的反應(yīng)時(shí)間 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.0838x - 0.0173，x 是標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量：nmol，y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘使 1nmol NADP+轉(zhuǎn)換成 1nmol NADPH 為一個(gè)酶活單位。 GPb（nmol/min /mg prot）＝[(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷ (V1×Cpr) ÷T=596.7×(ΔA+0.0173)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘使 1nmol NADP+轉(zhuǎn)換成 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活單位。 GPb（nmol/min/g 鮮重）＝[(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷(W× V1÷V) ÷T=596.7×(ΔA+0.0173)÷W 4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘使 1nmol NADP+轉(zhuǎn)換成 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活單位。 GPb（nmol/min/104 cell)= [(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷(500×V1÷V)÷T=1.19×(△A+0.0173) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.01 mL； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，2 min； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1nmol/μL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸餾水（母液需在兩 天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。