海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)試劑盒

海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用

海藻糖-6 磷酸合成酶（TPS）試劑盒說明書 （貨號：WS6550F 分光法 24 樣） 一、產品簡介： 海藻糖-6磷酸合成酶（TPS，EC 2.4.1.15）是海藻糖合成的關鍵酶之一，催化UDP- 葡萄糖和葡萄糖-6磷酸生成海藻糖-6磷酸和UDP。UDP與磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激 酶和乳酸脫氫酶的逐一作用下，使NADH氧化為NAD+，通過檢測NADH在340nm處的 下降量來計算TPS的酶活力大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 再加 0.9mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 液體 32mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 再加 2.2mL 蒸餾水溶解備用。 試劑四 粉劑 mg×4 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 分別加 0.55mL 蒸餾水溶解備用。用 不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止 反復凍融，三天內用完。 試劑五 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 紫外分光光度計、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱/金 屬浴、可調式移液器、研缽、冰。 四、海藻糖-6磷酸合成酶（TPS）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織樣本，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min， 取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 ② 細菌/真菌樣本： 先收集細菌或真菌到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細菌或真菌加入 1mL 提取 液；冰浴超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次），室溫晃動提取 30min， 8000rpm 室溫（25℃）離心 10min，取上清。 【注】：若增加樣本量，可按照提取液體積(mL) ：細菌或真菌數量（104個）為 1：500~1000 的比例提取 2、上機檢測： 1 紫外分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。 2 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 3 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 60 60本試劑盒僅供科研使用 2 試劑一 30 試劑二 210 240 混勻，35℃孵育 30min 后，立即于 95-100℃煮沸 5min， 10000rpm，4℃離心 5min，上清液待測。 4 在 1mL 石英比色皿中依次加入： 試劑二 400 400 試劑三 40 40 試劑四 40 40 試劑五 20 20 ③的上清液 200 200 混勻，35℃下立即于 340nm 處讀取各管吸光值 A1， 30min 后讀取 A2。△A=(A1-A2)測定-(A1-A2)對照。 【注】 1.若△A 的值在零附近，可以適當延長③歩的反應時間到 60min 后或更長，改變后的反 應時間需代入計算公式重新計算。或適當加大樣本量（如 100μL，則試劑二相應減少）， 則改變后的加樣體積 V1 需代入計算公式重新計算。 2. 若起始值 A1 太大如超過 2（如顏色較深的樣本）或ΔA 的值大于 0.4，可以適當減少 ③的上清液加樣量 V3（如減少至 100μL，則試劑二相應增加），則改變后的加樣體 積 V2 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算 單位定義：每毫克組織蛋白在每分鐘內氧化 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 TPS 活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V4÷（ε×d）×109] ×(V2÷V3) ÷(V1÷Cpr) ÷T =93.8×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計算 單位定義：每克組織在每分鐘內氧化 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 TPS 活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V4÷（ε×d）×109] ×(V2÷V3)÷(W×V1÷V) ÷T =93.8×ΔA÷W 3、按細菌或真菌數量計算： TPS 活力(μg/104cell)= [ΔA×V4÷（ε×d）×109]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V) ÷T =0.188×ΔA V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.06mL； V2---第③歩的反應總體積，0.3mL； V3---第④歩中所取上清液體積，0.2mL； V4---反應體系總體積，7×10-4 L； d---光徑，1cm； ε---NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm； W---樣本質量，g； 500---細菌或真菌總數，500 萬； T---反應時間，30min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測定試劑盒。