OligoGreen ssDNA 定量檢測試劑盒 *2000次*（效果同OliGreen）

OligoGreen ssDNA 定量檢測試劑盒 *2000次*（效果同OliGreen）試劑組成：

操作步驟：

1、試劑制備

PicaGreen dsDNA （Component A ）(定量試劑是以1mL 的濃縮液形式保存在無水的DMSO（二甲基亞砜）中。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，配制2XPicoGreen 試劑的操作溶液，用1xTE（Component B）按1:200 的比例稀釋濃縮液。如果要準(zhǔn)備足夠的操作溶液測定20 個(gè)樣品，可在20mL1x TE （Component B）中加入100μLPicaGreen dsDNA（Component A ） 定量試劑。由于試劑容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。PicaGreen 試劑（Component A ）見光易降解，所以應(yīng)將配好的溶液用錫箔包住或放置暗處避光保存。溶液在配制好數(shù)小時(shí)內(nèi)使用，以保證較佳結(jié)果。

2、 DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線 

2.1 預(yù)備1μg/mLdsDNA（ Component c） 或貯存液于1x TE 中。根據(jù)在1cm 光程長度的比色杯中A260nm 時(shí)的吸光度確定DNA 濃度；相應(yīng)于1μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。盡管任何純化的dsDNA 制劑都可用來做標(biāo)準(zhǔn)曲線，但常用的是小牛胸腺DNA。用跟被檢測的樣品相似的DNA 做標(biāo)準(zhǔn)曲線，用或長或短的線型DNA 段測定相近大小的酶切片段；質(zhì)粒用于測定質(zhì)粒DNA。然而大部分線狀dsDNA 分子，不管其片段長度大小，都會產(chǎn)生大致相等的信號。PicaGreen 試劑測定法在通常污染核酸制劑的幾種復(fù)合物存在的條件下仍能保持線狀，盡管信號強(qiáng)度可能受到影響。因此，為了得到有效的對照處理，被用來做標(biāo)準(zhǔn)曲線的dsDNA 溶液要用和實(shí)驗(yàn)樣品相同的方式來處理，并且應(yīng)該包含相同的可能存在的污染物。 

2.2 要產(chǎn)生從0.5ng/mL 到500ng/mL（見表1）單重復(fù)8 個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在2X 終濃度下配制一系列的DNA 溶液，混合相同體積的2XDNA 和2XPicaGreen 操作溶液，放入10×10mm 比色杯中。混合相同體積的1XTE 和2XPicaGreen 操作溶液以備空白對照。避光于室溫下放置2-5 分鐘。

表1 用10×10mm 比色杯時(shí)DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 當(dāng)用微量檢測皿適配器時(shí)，PicaGreen 測定也可在較低的測定體積（50μL 到200μL）內(nèi)完成。欲產(chǎn)生從1ng/mL 到100ng/mL（見表2）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在2X 終濃度下配制一系列的DNA 溶液，混合相同體積的2XDNA 和2XPicaGreen 操作溶液，將至少50μL 溶液轉(zhuǎn)移到微量檢測皿中。確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測皿的外部經(jīng)常可以驅(qū)散氣泡。避光于室溫下放置2-5 分鐘。

表2 用微量檢測皿時(shí)DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4孵育后用合適的熒光計(jì)測量樣品熒光值。選擇藍(lán)色激發(fā)光，用熒光值大的樣品校正儀

器。

2.5 測量剩余樣品的熒光值。不同的微型熒光計(jì)將給出一個(gè)直接的濃度讀數(shù)，數(shù)據(jù)可以用來產(chǎn)生DNA 濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，下面以TBS-380 微型熒光計(jì)為例。

 圖1     PicaGreen 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3、樣品分析

3.1 用1X TE 稀釋未知DNA 樣品至需要的體積（10×10mm 比色杯需1.0mL，微量檢測皿需25-100μL）。對樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被大限度地沖淡。然而，也要避免取樣體積太小而無法精確吸取的情況。去除樣品中RNA 和ssDNA 參照4 部分。

3.2 在每個(gè)樣品中加入2XPicaGreen 試劑的操作溶液（3.1 節(jié)準(zhǔn)備），混合好，將混合物移入合適的比色杯，避光于室溫下放置2-5 分鐘。

3.3 可以對樣品進(jìn)行不同的稀釋處理重復(fù)測定以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 去除樣品中單鏈核苷酸

當(dāng)ssDNA 與dsDNA 等摩爾濃度時(shí)，后者的測定受前者的干擾很小。前者濃度10 倍于后者時(shí)，。對熒光信號的干擾也不過10%。但當(dāng)DNA 濃度低時(shí)，ssDNA 能產(chǎn)生較大干擾在高濃度時(shí)，由RNA 結(jié)合PicaGreen 試劑產(chǎn)生的熒光值用RNA酶處理樣品可消除。RNA 酶A、酶T1 結(jié)合核酸酶S1 能除去所有單鏈核酸，從而保證樣品熒光值是由dsDNA 產(chǎn)生。（具體做法請查閱相關(guān)的參考文獻(xiàn)）